三代測序的原理

一、測序原理先介紹 nanopore 測序中的幾位主角：
reader ：在自然界中，有一種可以嵌入到細胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有**的蛋白納米孔。經(jīng)過人為基因工程修飾后，得到的就是 nanopore 測序所需的 reader 蛋白。
membrane：reader 蛋白會被嵌入到高電阻率的 membrane （人工合成的多聚物膜），膜兩側(cè)是離子溶液，在兩側(cè)加不同的電位，離子就會在孔中流動，形成電流。
motor：在 nanopore 文庫構(gòu)建時，需要在接頭上連接一種動力蛋白，用于將dna或rna分子推入納米孔中。以dna解螺旋酶作為 motor（動力蛋白）為例，它可以除了可以解開雙螺旋，使之變?yōu)閱捂?，還可以提供推動力。
tether：該蛋白用于錨定dna或rna鏈，防止在溶液中飄動，并使其進入納米孔中。
這時，解開的其中一條鏈會穿過蛋白質(zhì)孔，它在通過蛋白孔時，會對膜兩邊離子的穩(wěn)定流動產(chǎn)生擾動。不同的堿基，對離子流的影響不同，也就會產(chǎn)生不同的電流大小，進而形成下面的電流信號圖。
利用這些電流信號，使用計算機軟件識別后，推斷出堿基類型，完成測序。
二、測序儀介紹雖然 nanopore 測序儀種類很多，但都是基于nanopore芯片來搭建的平臺，大到由多個芯片陣列組成的promehion，gridion系列測序儀，小到可以連接手機的type c，電腦usb的mnion系列便攜式測序儀。
這里邊，較*的就是mnion系列，2016年8月，美國宇航員凱特·魯賓斯在**空間站完成微重力條件的dna測序。
它在測序時，一般像下圖這樣連接就行，顯而易見的便攜性。比如，可以直接用它在深入疫區(qū)采集樣本后進行實時分析，為防疫工作爭取大量寶貴的時間和資源。
測序時，將制備好的文庫或樣本溶液，滴在芯片小孔中，開始測序。
一張芯片中有 2048 個 membrane wells，也就是芯片上的一個孔，每個孔包含一個nanopore reader。
每四個 wells 共享一個 amplifier（信號放大器），一張芯片中有 512 個信號放大器，也就是 512 組 wells。
在啟動測序儀后，機器自檢，會將每組 wells 中依據(jù)效率高低排序。測序開始，儀器先用每組 wells 中效率較高的 wells，運行 8 小時后，更換效率*二的，以此類推。
但是，在實際使用過程中，只有 1200 個 wells可以正常工作。
造成 wells 失效的原因：
wells 中沒有 reader 蛋白，或納米孔不通，這時無電信號
膜破損，這時有強電信號，不能正常測序
在單個 well 中有兩個及以上的 reader 蛋白，電信號互相干擾
三、建庫方法1、1d 文庫1d文庫是將dna雙鏈，解鏈為正義鏈與反義鏈，分別測序，大約有 85% 的堿基判讀準(zhǔn)確率。
目前1d文庫有兩種建庫方案：
標(biāo)準(zhǔn)建庫
將 dna 打斷
補齊dna末端，末端加 a 堿基
連接 adapter（ 接頭序列），接頭上連有 motor 蛋白
接頭中有一段序列可以與 tether 蛋白結(jié)合，作用是為了將 dna 鏈吸附在膜上，將 dna 錨定，不易被溶液洗走
下圖是 tether 與接頭序列識別及錨定過程
轉(zhuǎn)座酶建庫
建庫時使用連有測序接頭的轉(zhuǎn)座酶，該酶可以將長鏈 dna 鏈切斷
由于該酶的特性，會在dna的斷點兩端加接頭序列
隨后在測序接頭加入 motor 蛋白
2、 文庫在 dna 兩側(cè)接 接頭，其他步驟和 1d 文庫類似。
這種文庫中的 接頭，可以讓*二鏈緊跟**鏈來一起測序。
由于可以測到兩條鏈，可以相互矯正，進而提高判讀準(zhǔn)確率，能達到 90%以上的堿基判讀準(zhǔn)確率。
但是，由于文庫質(zhì)量，蛋白活性等因素，導(dǎo)致并不是所有的**鏈后都會測到*二鏈。
四、堿基判讀在測序過程中，得到的信號并不是每次測得一個堿基信號。而是根據(jù) reader 蛋白孔的縱向長度，r9 大約為 5 個堿基長，也就是說，同時會測得 5 個堿基的電信號，這并不是一項簡單的判斷過程。
目前，nanopore 公司采用一種機器學(xué)習(xí)方法，遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（rnn），對堿基進行判讀。
該過程簡單來說，是將已知堿基序列的電信號波形圖做訓(xùn)練集和測試集，通過修正參數(shù)，拿到模型。最后，將新測到的未知序列的波形圖與之比對，從而提高判讀準(zhǔn)確率。
但是，還是有誤讀情況：
由于空間結(jié)構(gòu)相似性，嘌呤間誤讀，嘧啶間誤讀較容易發(fā)生。
堿基復(fù)雜度低的序列（如，polya序列），較容易誤讀
五、測序影響因素電壓以r9芯片為例，測序過程，先用 180 mv 電壓，每 10 min，短時間翻轉(zhuǎn)電壓方向，作用是激活被堵住或卡住的 reader 蛋白孔。但是，這個過程也會使正常測序的 dan鏈倒吐回去。
隨著電極使用時間的增加，電極的電壓會發(fā)生漂移，因此每過兩小時，要增加 5mv 電壓抵消影響。
速度與產(chǎn)量r9 芯片，測序速度是 250 堿基/s，一張芯片可以得到約 5 ~ 10 g的堿基序列。
北京立博泰業(yè)科技有限公司專注于離心機,三代測序,純水儀,正倒置一體研究級顯微鏡等